Press Release: Shedding Light on Protein Activitie — Journal of Young Investigators

Announcing Undergraduate Research Funding? Submit your applications until April 30th

Press Release: Shedding Light on Protein Activitie

Press Release: Shedding Light on Protein Activities

June 1, 2022

SEPTIA NURMALA

“San Diego beach scene drawn with an eight color palette of bacterial colonies expressing fluorescent proteins derived from GFP and red-fluorescent coral protein” by Nathan Shaner CC BY-SA 3.0

The abundance of protein has long intrigued researchers. With more than 20,000 protein molecules currently identified, researchers are racing to unravel their roles in human health and disease. To do this, researchers monitor protein activities inside a cell using a tag that produces light in nature. However, who would have thought that this light-producing tag is also a protein molecule termed as a bioluminescent? In a scoping review published in the March issue of the Journal of Young Investigators, Kwing Yeung Chan, Hugo Yat Hei Kwong, and Dei Men Szeto from the University of Hong Kong recount the chronicle of a specific bioluminescent from its discovery to its application.

The tag was first discovered in the jellyfish Aequorea victoria, which emitted greenish light deep in the cold Pacific Ocean. But when Osamu Shimomura, the researcher who first identified this bioluminescence system, extracted the fluorescent protein aequorin, the molecule glowed bluish. This baffling phenomenon led him to postulate the existence of a second, green light emitting protein. And surely, after further purifications, he found a molecule that was able to emit green light by absorbing the blue light produced by aequorin, thus explaining the jellyfish’s signature green color. Shimomura later named this molecule Green Fluorescent Protein (GFP).

Researchers quickly jumped on the bandwagon to study the properties of GFP from its structure to how this tiny molecule scintillates. As is the case with any other protein, GFP is composed of 20 different amino acids. With a total of 238 building blocks, GFP forms a barrel structure from 11 concatenated strands enclosing the core responsible for coloring the protein. Such conformation is essential for fluorescence. When the right shape is acquired, natural GFP undergoes maturation in the form of post-translational modification. Serine, tyrosine, and glycine, amino acids that make up the chromophore, react with each other’s functional group to produce distinct wavelengths that can be visualized using widely available detection methods.

Even after revealing the chemistry of GFP, researchers still could not inject this molecule into mammalian cells to study the cells’ properties. There were drawbacks concerning the strength of the fluorescence signal and stability at the cell's normal temperature. To avoid this, researchers hopped onto the engineering of GFP that proved to be beneficial. By using a method called DNA shuffling, where strands of DNA will be randomly fragmented and reassembled, GFP’s light spectrum expands and its brightness increases, even at mammalian cells' normal temperature. One notable example is the emergence of rainbow panels — a derivation from monochromatic green into a multicolored hue produced by bacteria incubated at 37oC.

Getting creative with the GFP gene did not stop there. Researchers split the synthesis of GFP into two chunks. One segment contains only 10 strands, called GFP1-10, and the smaller one is GFP11. They call this system split-GFP. The two segments do not fluoresce when detached; but once they are in close proximity, they will auto-assemble to produce fluorescence. GFP1-10 is broken down further, adding one more part to the split-GFP system. This is called a tripartite system that consists of GFP1-9, GFP 10, and GFP 11. This system works the same way as the bipartite system.

After all these efforts, one may wonder how GFP is utilized to support protein research. One practical use for this light-producing molecule is to paint a picture of the cell’s machinery. Proteins are the molecules that do most of the work inside cells. Once they’re produced and mature, they migrate to other compartments of cells to carry out their tasks. GFP acts as a tag and helps track them down. Moreover, understanding protein-protein interactions (PPI) and formation of protein complexes are made easier with the emergence of the split-GFP system. In the review, the authors give an example of a successful PPI mediated by a small molecule that can be detected by the tripartite system. Rapamycin, a small molecule, is an immunosuppressant that induces FKBP-FRB protein binding. FRB is paired with GFP10 fragments, whereas FKBP protein is paired with GFP11. Rapamycin catalyzes the binding, but GFP10-11 does not report a strong signal of this interaction. Adding GFP1-9 to E. coli culture – the study subject – produces a more vivid image of this interaction through an increase in fluorescence as GFP1-9 binds the complex more tightly.

GFP is an indispensable tool in molecular biology as it helps researchers see things inside the cells. It works as general as mapping out protein location in an organism to conceiving specific methods to study specialized types of cells. The authors argue that even if GFP has added more nuances to a cell's machinery, further modifications of GFP with gene-editing tools are expected. Diversifying GFP variants by making them acid-tolerant and light-controlled will illuminate future proteomics studies, and seeing the universe of cells in a real-time kaleidoscopic image might not be an arcane concept anymore.

References

Comunicado de prensa: Arrojando luz sobre las actividades de las proteínas

1 de junio 2023

SEPTIA NURMALA

Julia Goralsky

“Escena de la playa de San Diego dibujada con una paleta de ocho colores de colonias bacterianas que expresan proteínas fluorescentes derivadas de GFP y proteína coralina fluorescente roja” por Nathan Shaner CC BY-SA 3.0

La abundancia de proteínas ha intrigado durante mucho tiempo a los investigadores. Con más de 20.000 moléculas de proteínas identificadas actualmente, los investigadores se apresuran a descifrar sus papeles en la salud y la enfermedad humanas. Para hacer esto, los investigadores monitorizan las actividades de las proteínas dentro de una célula usando una etiqueta que produce luz en la naturaleza. Sin embargo, ¿quién hubiera pensado que esta etiqueta productora de luz es también una molécula de proteína denominada bioluminiscente? En una revista de alcance publicada en el número de marzo de Journal of Young Investigators, Kwing Yeung Chan, Hugo Yat Hei Kwong y Dei Men Szeto de la Universidad de Hong Kong relatan la crónica de un bioluminiscente específico desde su descubrimiento hasta su aplicación.

La etiqueta se descubrió por primera vez en la medusa Aequorea victoria, que emitía una luz verdosa en las profundidades del frío Océano Pacífico. Pero cuando Osamu Shimomura, el investigador que identificó por primera vez este sistema de bioluminiscencia, sacó la proteína fluorescente aequorina, la molécula brilló azulada. Este desconcertante fenómeno le llevó a postular la existencia de una segunda proteína emisora de luz verde. Y seguramente, después de más purificaciones, encontró una molécula que era capaz de emitir luz verde al absorber la luz azul producida por la aequorina, explicando el color verde característico de la medusa. Shimomura nombró más tarde esta molécula Proteína Verde Fluorescente (GFP). 

Los investigadores se subieron rápidamente al carro para estudiar las propiedades de la GFP desde su estructura hasta cómo centellea esta pequeña molécula. Como en el caso de cualquier otra proteína, la GFP se compone de 20 aminoácidos diferentes. Con un total de 238 bloques de construcción, la GFP forma una estructura de barril de 11 hebras concatenadas que encierran el núcleo responsable de colorear la proteína. Esta conformación es esencial para la fluorescencia. Cuando se adquiere la forma correcta, la GFP natural experimenta una maduración en forma de modificación postraduccional. La serina, la tirosina y la glicina, aminoácidos que constituyen el cromóforo, reaccionan con el grupo funcional de otro para producir distintas longitudes de onda que pueden visualizarse utilizando métodos de detección ampliamente disponibles. 

Ni siquiera después de revelar la química de la GFP pudieron los investigadores inyectar esta molécula en células de mamífero para estudiar sus propiedades. Había inconvenientes relacionados con la intensidad de la señal de fluorescencia y la estabilidad a la temperatura normal de la célula. Para evitar esto, los investigadores recurrieron a la ingeniería de la GFP, que demostró ser beneficiosa. Mediante un método llamado “DNA shuffling,” en el que las hebras de ADN se fragmentan y recomponen aleatoriamente, el espectro luminoso de la GFP se amplía y su brillo aumenta, incluso a la temperatura normal de las células de mamífero. Un ejemplo notable es la aparición de paneles de arcoíris - una derivación del verde monocromático a una tonalidad multicolor producida por bacterias incubadas a 37 grados centígrados.

La creatividad con el gen GFP no se detuvo ahí. Los investigadores dividieron la síntesis de GFP en dos trozos. Un segmento contiene sólo 10 hebras, denominado GFP1-10, y el más pequeño es GFP11. Llaman a este sistema “split-GFP.” Los dos segmentos no emiten fluorescencia cuando están separados; pero una vez que están cerca, se ensamblarán automáticamente para producir fluorescencia. La GFP1-10 se descompone aún más, añadiendo una parte más al sistema “split GFP.” Este se denomina un sistema tripartito que consiste en GFP1-9, GFP 10 y GFP 11. Este sistema funciona de la misma manera que el sistema bipartito. 

Después de todos estos esfuerzos, uno se puede preguntar cómo se utiliza la GFP para apoyar la investigación de proteínas. Un uso práctico de esta molécula productora de luz es pintar un cuadro de la maquinaria celular. Las proteínas son las moléculas que hacen la mayor parte del trabajo dentro de las células. Una vez que se producen y maduran, migran a otros compartimentos de las células para realizar sus trabajos. La GFP actúa como etiqueta y ayuda a rastrearlas. Además, la comprensión de las interacciones proteína-proteína (PPI) y la formación de complejos de proteínas se facilitan con la aparición del sistema “split-GFP.” En la revista, los autores dan un ejemplo de una PPI exitosa mediada por una molécula pequeña que puede detectarse por el sistema tripartito. La rapamicina, una pequeña molécula, es un inmunosupresor que induce la unión de la proteína FKBP-FRB. FRB se empareja con fragmentos de GFP10, mientras que la proteína FKBP se empareja con GFP11. La rapamicina cataliza la unión, pero GFP10-11 no informa de una señal fuerte de esta interacción. La adición de GFP1-9 al cultivo de E. coli - el sujeto del estudio - produce una imagen más vívida de esta interacción a través de un aumento de la fluorescencia ya que GFP1-9 se une más firmemente al complejo.

La GFP es una herramienta indispensable en biología molecular, ya que ayuda a los investigadores a ver cosas dentro de las células. Su función es tan general como mapear la ubicación de proteínas en un organismo hasta concebir métodos específicos para estudiar tipos especializados de células. Los autores argumentan que, aunque la GFP haya añadido más matices a la maquinaria celular, se esperan más modificaciones de la GFP con herramientas de edición de genes. Diversificar las variantes de la GFP haciéndolas tolerantes a los ácidos y controladas por la luz iluminará los futuros estudios proteómicos, y ver el universo de las células en una imagen caleidoscópica en tiempo real podría dejar de ser un concepto arcano.   

Referencias

Share

Stay up-to-date on news and publications: